Использование воды с микропузырьками для удаления микробной биопленки с ортодонтических конструкций – исследование in vitro (часть 1).

Ортодонтические конструкции часто провоцируют заболевания полости рта, такие как кариес и гингивит, возникающие вследствие прикрепления биопленки. Тем не менее, надежных методов удаления биопленки с таких конструкций очень мало. Целью данного исследование было изучение способности воды с микропузырьками удалять биопленки, образованные Streptococcus mutans или Candida albicans, с ортодонтических конструкций. Для этого конструкции с биопленкой погружали в воду, обогащенную микропузырьками, после чего оценивали остаточную биопленку на конструкциях с помощью микропланшетного спектрофотометра. Вода с микропузырьками показала высокую эффективность в удалении биопленки с ортодонтических конструкций. Эффект воды с микропузырьками был значительно более выраженным по сравнению с водопроводной водой (S. mutans: p<0.05, C.albicans: p<0.01). Результаты этого исследования позволяют предположить, что вода с микропузырьками эффективна в удалении биопленки из полости рта ортодонтических пациентов.

Mio MUKUMOTO,* Tomoko OHSHIMA,** Miwa OZAKI,* Hirokazu KONISHI,*** Nobuko MAEDA** и Yoshiki NAKAMURA*

*Кафедра ортодонтии, Школа Стоматологии Университета Цуруми, Йокогама, Япония;
**Отдел микробиологии полости рта, Школа Стоматологии Университета Цуруми, Йокогама, Япония;
***Кафедра детской стоматологии, Школа Стоматологии Университета Цуруми, Йокогама, Япония;

Ключевые слова: вода с микропузырьками, удаление биопленки, ортодонтические конструкции 

Введение
Фиксированные и съемные конструкции являются неотъемлемыми инструментами для лечения ортодонтических пациентов. Однако их установка часто приводит к формированию биопленок, содержащих ряд специфических микроорганизмов, которые способны вызывать заболевания полости рта[1-3]. В ротовой полости пациентов с установленными фиксированными конструкциями повышается концентрация типичной кариесогенной бактерии, S. mutans [4]. Hibino с соавт. показали, что из полости рта ортодонтических пациентов со съемными конструкциями также часто выделяют оппортунистический патоген C. albicans [5]. Эти микроорганизмы, образующие биопленку, могут попадать в кровоток, вызывая бактериемию. Поэтому так важно удалять их с ортодонтических конструкций.
Существуют различные методы удаления биопленки. Изучалось применение с этой целью ионных зубных щеток, однако, существенного эффекта в отношении удаления биопленки или сокращения проявлений гингивита не было отмечено [6]. Ирригаторы полости рта также использовались с этой целью [7]. Однако эти устройства оказались не более эффективными, чем обычная зубная щетка или зубная нить. Более того, не было обнаружено статистически значимых различий между результатами полоскания ротовой полости хлоргексидином или использования антимикробных зубных паст и обычными методами гигиены [8]. Удаление биопленки, необходимое для поддержания гигиены полости рта, остается серьезной клинической проблемой.
Вода с микропузырьками ранее применялась в различных областях: для неинвазивной оценки воспаления, расщепления органических веществ, очистки сточных вод, и в пищевой промышленности [9-18]. Существует всего несколько сообщений об ее использовании в стоматологии с целью удаления микроорганизмов. Sharma с соавт.сообщают о том, что при использовании воды с микропузырьками Streptococcus oralis полностью устранялся из слюнных пленок, однако, достичь полного удаления Actinomyces naeslundii не удавалось [19-20]. Ни в одном исследовании до настоящего момента не проводилась оценка эффективности воды с микропузырьками в устранении таких важных патогенов полости рта, как S. mutans и C.albicans, являющихся одними из главных компонентов биопленок на ортодонтических конструкциях. S. mutans чаще обнаруживается на фиксированных конструкциях [4], в то время как C. albicans – на съемных [5].
Целью данного исследования было выяснить, обладает ли вода с микропузырьками значимой способностью к удалению биопленок, образованных двумя патогенами, с ортодонтических конструкций.

Материалы и методы
Производство воды с микропузырьками
Воду с микропузырьками (ВМ) производили в резервуаре с помощью специального устройства (Рис. 1, Shinwa Co., Ltd. Токио, Япония). Для подтверждения формирования в воде микропузырьков, их диаметр измерялся. Образцы по три раза забирались из верхней и нижней частей резервуара с водой. Распределение микропузырьков по размерам оценивалось с помощью методики динамического рассеяния света (Zeta size nano-ZS, Sysmex Co., Ltd., Хёго, Япония).

Рисунок 1. Генератор воды с микропузырьками.
1 – резервуар с водой
2 – верхний кран
3 – нижний кран

Эксперимент I: Использование воды с микропузырьками для удаления биопленки S. mutans с брекетов
Металлические или пластиковые брекеты (Металлические брекеты, Пластиковые брекеты, Tomy Co., Ltd., Токио, Япония) помещали в лунки 96-луночного планшета. Концентрация бактерий S. mutans ATCC 25175 в сердечно-мозговом бульоне (СМБ) с 5% сахарозой находилась в пределах от 10^6 до 10^7 КОЕ/мл. Аликвотные доли по 100 мкл S.mutans добавляли в каждую лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°С. Затем супернатант культуры удаляли из лунок, после чего в них наливали воду с микропузырьками. Последовательное наполнение каждой лунки водой и ее опустошение с помощью микропипеток продолжали на протяжении 3 минут. В качестве контроля использовалась водопроводная вода (ВВ). Супернатант сливали из каждой лунки, после чего в них заливали 100 мкл питательной среды (Beckton Dickinson&Co., Мэриленд, США) с 10% редокс-индикатором (Alamar blue®, TREK Diagnostic Systems, Кливленд, Огайо, США) и инкубировали в течение 24 часов при 37°С. В дальнейшем с помощью микропланшетного спектрофотометра (Multiskan Multisoft, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., Осака, Япония) проводилось измерение оптической плотности при длине волны 540 нм. Данные измерений в группе ВМ сравнивались с данными из группы ВВ.

Рисунок 2. Пластиковый брекет закреплялся на щечной поверхности каждого зуба с помощью полимерцемента.

Эксперимент II: Использование воды с микропузырьками для удаления биопленки S. mutans с фиксированных конструкций
В исследовании использовались шесть интактных верхних первых премоляров от шести ортодонтических пациентов, подписавших информированное согласие. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университета Цуруми. После стерилизации зуба в автоклаве на его щечной поверхности с помощью полимерцемента закреплялся пластиковый брекет (Рис. 2, Super-Bond, SUN MEDICAL Co., Ltd., Шига, Япония). Зуб с брекетом фиксировался твердым парафином (Paraffin wax, FEED Co., Ltd., Канагава, Япония) на внутренней стороне колпачка чистого контейнера, и контейнер вместе с зубом и колпачком дезинфицировали 70% этанолом. Зубы с брекетами погружали в 1.5 мл отфильтрованной слюны человека в 24-луночном планшете и оставляли на ночь при температуре 4°С с целью создания слюнной пленки на их поверхности. После возникновения пленки их помещали на дно чистого контейнера. S. mutans культивировали по методике, описанной выше, после чего 5 мл культуры S. mutans добавляли в контейнер с зубом и культивировали на протяжении двух дней при 37°С. Затем зуб с брекетом на колпачке переносили в новый стерильный пластиковый контейнер с двумя отверстиями для введения жидкости и опустошения, к каждому из которых было подсоединено по силиконовой трубке. В трубку вставлялся стерильный шприц, с помощью которого в контейнер со скоростью 1 мл/сек вводилось 50-100 мл воды с микропузырьками или водопроводной воды. Из части контейнеров сразу после введения воды проводилось ее удаление через вторую трубку (группа А). В других контейнерах воду оставляли на 3 минуты, после чего также удаляли (группа В). Остаточная биопленка определялась с помощью окрашивания зубного налета (Dent liquid plaque tester, LION Co., Ltd., Токио, Япония). После снятия брекета с зуба при помощи инструмента для снятия брекетов (Bracket remover, Tomy Co., Ltd., Токио, Япония), окрашенную биопленку экстрагировали с поверхностей брекета и зуба с помощью 70% этанола. После этого, с целью количественной оценки остаточной биопленки с помощью спектрофотометра (UV-1200, SHIMADZU Co., Ltd. Киото, Япония) при OD540 измерялась оптическая плотность экстрактов с обеих поверхностей. Проводилось сравнение данных с зубов, после омывания которых вода немедленно удалялась, и зубов, контактировавших с водой в течение 3 минут.

Эксперимент III: Использование воды с микропузырьками для удаления биопленки C.albicans с полистирольного планшета, имитирующего съемную конструкцию
96-луночный полистирольный микротитровальный планшет использовался в качестве имитации съемной ортодонтической конструкции. Микробное число C. albicans АТСС 18804 в триптическом соевом бульоне (ТСБ) с 4% глюкозой находилось в пределах 10^6 – 10^7. Аликвотные доли по 100 мкл C. albicans вносились в каждую лунку и культивировались в течение 24 часов при 37°С с целью создания биопленки на планшете. Супернатант культуры сливали, и биопленки на поверхности лунок обрабатывали по схеме, описанной в эксперименте I. Оценка C. albicans и остаточной биопленки также проводилась по схеме, описанной в эксперименте I. Данные группы ВМ сравнивали с данными группы ВВ.
Эксперимент IV: Использование воды с микропузырьками для удаления биопленки C.albicans со съемной конструкции
Из полистирольных планшетов (Clear Retainer, Oral Care, Токио, Япония) были сформированы шесть съемных конструкций и продезинфицированы 70% этанолом. Конструкции помещались в стерильный стеклянный контейнер со 100 мл культуры C. albicans, подготовленной по методике, описанной в эксперименте III. В течение 3 дней проводилась их инкубация, затем их переносили в стеклянные контейнеры, наполненные водопроводной водой с целью удаления непрочно фиксированных грибов, после чего погружали в другие стеклянные контейнеры, наполненные водой с микропузырьками или обычной водопроводной водой. Конструкции оставляли в воде на 10 мин, после чего вынимали из контейнеров и окрашивали красителем для зубного налета. Количественная оценка остаточной биопленки на конструкции проводилась по методике, использованной в эксперименте III.

Статистический анализ
Каждый эксперимент проводили по 3 раза. Сравнение данных всех экспериментов проводилось между группами, где использовалась вода с микропузырьками и группами, где применяли водопроводную воду, с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р менее 0.05. Статистический анализ проводился при помощи программного обеспечения SPSS 11.0 (SPSS, Чикаго, США).

Результаты
Размер микропузырьков
Распределение размеров микропузырьков оценивалось с помощью метода динамического светорассеяния. Размер микропузырьков, полученных из верхней и нижней частей резервуара с водой измерялся 6 раз с помощью счетчика частиц в жидкости. По результатам измерения средний диаметр микропузырьков составил 531.1±39.46 нм в нижней части резервуара и 613.6±210.41 нм в верхней части. Соответственно, для данного исследования использовалась вода с микропузырьками из нижней части.

Эффективность воды с микропузырьками в удалении биопленки S. mutans с брекетов
Эффект воды с микропузырьками в отношении биопленки S. mutans сравнивался с воздействием обычной водопроводной воды. Для исследования использовались металлические или пластиковые брекеты, которые были помещены в 96-луночные планшеты. Объем остаточной биопленки S. mutans на металлических брекетах оценивался при помощи редокс-индикатора и оптической плотности при 540 нм, и был значительно ниже в группе ВМ по сравнению с группой ВВ (Рис. 3а, **р<0.01). Показатели остаточной биопленки на пластиковых брекетах были также значительно ниже в группе ВМ, чем в группе ВВ (Рис. 3б, *р<0.05). Таким образом, вода с микропузырьками (группа ВМ) оказывала значительно больший эффект, чем водопроводная вода (группа ВВ) как в случае с металлическими, так и в случае с пластиковыми брекетами.

Рисунок 3. Эффект воды с микропузырьками при удалении биопленки S. mutans с брекетов
а: Остаточное количество S. mutans на металлических брекетах
б: Остаточное количество S. mutans на пластиковых брекетах
Вертикальная ось графика показывает остаточное количество микробов, измеряемое с помощью редокс-индикатора и оптической плотности при 540 нм.